Callus Culture

UPDATED ON:- 01-07-2023

कैलस संवर्धन (Callus Culture):-

1. परिचय (Introduction):-

·       कैलस (Callus):- समसूत्री विभाजन द्वारा वृद्धि कर रही कोशिकाओं का अविशिष्ट व असंगठित समुह कैलस कहलाता है।

(The non-specific and unorganized group of cells growing by mitosis is called callus.)

·       जब कर्तोतक को ओक्सिन व साइटोकाइनिन की सही मात्रा युक्त ठोस अगार माध्यम पर संवर्धित किया जाता है तो कैलस उत्पन्न होता होता है। ओक्जिन में 2,4 – D का उपयोग सामान्य रूप से किया जाता है।

(Callus is produced when the explant is cultured on a solid agar medium containing the suitable amount of auxin and cytokinin. 2,4 - D is commonly used as auxin.)

·        कैलस निर्माण के दौरान आकारिकी व उपापचय में कुछ हद तक विविभेदन होता है। जिससे वे प्रकाश संश्लेषण की क्षमता को खो देते हैं।

(There is some degree of dedifferentiation in morphology and metabolism during callus formation. Due to which they lose the ability of photosynthesis.)

·        कैलस ऊतक का एक प्रवर्ध (blob) होता है जिसमें अधिकांश कोशिकाएं अविभेदित होती हैं।

(Callus is a blob of tissue in which most cells are undifferentiated.)

·        किसी पौधे में घाव हो जाने पर वहाँ कैलस प्राकृतिक रूप से विकसित होता है।

(Callus develops naturally when there is a wound in a plant.)

·    कैलस संवर्धन (Callus Culture):- जब कैलस को निर्जमित दशाओं में कृत्रिम ठोस अगार माध्यम पर संवर्धित किया जाता है तो इसे कैलस संवर्धन कहते हैं।

(When the callus is cultured on artificial solid agar medium in sterilized conditions, it is called callus culture.)

2. इतिहास (History):-

·         R. J. Gautheret (1934-37):- इसने सबसे पहले Salix capraea पौधे की एधा (Cambium) से कैलस विकसित करने में सफलता प्राप्त की।

(He first succeeded in developing callus from the cambium of the Salix capraea plant.)

·         P. Nobecourt (1939):- इसने ठोस अगार माध्यम पर असीमित वृद्धि क्षमता रखने वाले कैलस संवर्धन को सबसे पहले स्थापित किया। इसने गाजर (Daucus carota) की मूसला मूल को लेकर कार्य प्रारम्भ किया।

(He first established the callus culture having unlimited growth potential on a solid agar medium. He started work on the tap root of Daucus carota.)

·         J. Van Overbeck, M. E. Conklin and A. F. Blakeslee (1941):- इन्होने सबसे पहले नारियल के पानी (Cocconut Milk) का कैलस संवर्धन में महत्व का पता लगाया।

(He first discovered the importance of coconut milk in callus culture.)

·         S. M. Caplin and F. C. Steward (1948):- इन्होने गाजर से विभेदित Non – Cambial कोशिकाओं को पृथक करके नारियल पानी युक्त माध्यम पर वृद्धि प्राप्त करने में सफलता प्राप्त की।

(They succeeded in achieving growth on a medium containing coconut milk by isolating differentiated non - cambial cells from carrot.)

·         F. Skoog (1954-1955):- इसने औक्जिन युक्त पोषक माध्यम पर तम्बाकू के तने से काटे गए टुकड़े से कैलस संवर्धन प्राप्त करने में सफलता प्राप्त की। कैलस कुछ समय के लिए सक्रिय रहा तथा वृद्धि करने में असफल रहा।

(He succeeded in obtaining callus culture from a piece of tobacco stem cutting on a auxin containing medium. Callus remained active for some time and failed to grow.)

·      F. Skoog and C. O. Miller (1957):- इन्होने सबसे पहले कैलस ऊतक से अंग निर्माण के हार्मोन्स द्वारा नियंत्रण की अवधारणा प्रस्तुत की। इन्होने बताया कि माध्यम में औक्जिन व काइनेटिन की समान मात्रा कैलस ऊतक की सतत वृद्धि को प्रेरित करती है।

(He first introduced the concept of hormonal control of organ formation from callus tissue. They reported that equal amounts of auxin and kinetin in the medium stimulate the continuous growth of callus tissue.)

3. सिद्धान्त (Principle):- कैलस संवर्धन के सफल प्रारम्भ के लिए तीन महत्वपूर्ण आवश्यकतायें पूर्ण होनी चाहिए –

(Three important requirements must be met for a successful initiation of callus culture -)

i. पादप सामग्री को निर्जमित परिस्थितियों में तैयार करना। इसके लिए सतही निर्जमीकरण किया जाता है।

(Preparation of plant material under sterilized conditions. Surface sterilization is done for this.)

ii. उपयुक्त पोषक माध्यम का चयन करना जिसमें औक्जिन व साइटोकाइनिन सही अनुपात में उपस्थित हों। कैलस वृद्धि के लिए 1 : 1 का अनुपात होना चाहिए।

(Selecting the appropriate nutrient medium in which auxin and cytokinin are present in appropriate proportion. There should be a ratio of 1: 1 for callus growth.)

iii. नियंत्रित भौतिक परिस्थितियों में संवर्धन का ऊष्मायन करना।

(Incubation of culture under controlled physical conditions.)

Ø  कैलस ऊतक निर्माण के सही प्रारम्भ के लिए ताप, प्रकाश व आर्द्रता की नियंत्रित दशायें उपस्थित होना अनिवार्य है।

(It is necessary to have controlled conditions of heat, light and humidity present for the correct initiation of callus tissue formation.)

Ø  25 ±2°C तापमान उपयुक्त माना जाता है।

(A temperature of 25 ± 2 ° C is considered appropriate.)

Ø  कुछ पादपों में कैलस निर्माण के लिए 24 घंटे अंधेरे की आवश्यकता होती है जैसे – गाजर। अन्य पादपों में 16 घंटे प्रकाश व 8 घंटे अंधेरे की आवश्यकता होती है। कृत्रिम प्रकाश की तीव्रता 2000 से 3000 लक्स होनी चाहिए। कृत्रिम प्रकाश देने के लिए ठंडे व सफ़ेद लैम्पों का उपयोग किया जाता है।

(In some plants, 24 hours of darkness is required for developing callus such as carrot. Other plants require 16 hours of light period and 8 hours of dark period. The intensity of artificial light should be 2000 to 3000 lux. Cold and white lamps are used to provide artificial light.)

Ø  सामान्यतया 55 से 60% सापेक्षिक आर्द्रता संवर्धन कक्ष में बनाकर रखी जाती है।

(Generally 55 to 60% relative humidity is maintained in the culture chamber.)

4. विधि (Procedure):-

·         गाजर की एक ताजा मूसला मूल लेते हैं तथा बहते हुये नल के पानी में धोते हैं ताकि सतह पर उपस्थित धूल मिट्टी आदि को हटाया जा सके।

(Take a fresh tap root of carrot and wash it in running tap water to remove dust, dirt etc. from the surface.)

·         अब एक तीखे चाकू या ब्लेड की सहायता से गाजर के 1 mm मोटे अनुप्रस्थ टुकड़े काटते हैं और इन टुकड़ों को फिल्टर पेपर युक्त निर्जमित पेट्रीडिश में स्थानांतरित करते हैं।

(Now, cut 1 mm thick transverse pieces of carrots with the help of a sharp knife or blade and transfer these pieces to sterilized patridish containing filter paper.) 

·         अब इन टुकड़ों को 10 मिनट के लिए 5℅ Teepol विलयन में डुबोकर रखते हैं और फिर पानी से धो लेते हैं।

(Now soak these pieces in 5℅ Teepol solution for 10 minutes and then wash them with water.)

·        अब इन टुकड़ों के सतही निर्जमीकरण के लिए पहले 60 सेकंड के लिए 70℅ एथेनोल में डुबोते हैं और बाद में 20 – 25 मिनट के लिए 0.8℅ सोडियम हाइपोक्लोराइट विलयन में डुबोकर रखते हैं।

(Now for surface sterilization of these pieces, first immerse them in 70℅ ethanol for 60 seconds and later in 0.8℅ sodium hypochlorite solution for 20 - 25 minutes.)

·         अब इन टुकड़ों को 3 बार निर्जमित आसुत जल से धोते हैं ताकि सतह पर उपस्थित अतिरिक्त रसायन को हटाया जा सके।

(Now wash these pieces 3 times with sterilized distilled water to remove excess chemical present on the surface.)

·         प्रत्येक टुकड़े को एक अन्य निर्जमित पेट्रीडिश में स्थानांतरित करते हैं। प्रत्येक टुकड़े में पिथ के चारों ओर एधा का एक सफ़ेद वृताकर घेरा पाया जाता है। अब प्रत्येक अनुप्रस्थ टुकड़े से एधा से होता हुआ 4 mm² क्षेत्र का एक छोटा टुकड़ा काटते हैं ताकि इस छोटे टुकड़े में फ्लोएम, एधा व जाइलम आ सकें। कर्तोतकों का आकार व मोटाई एक समान होनी चाहिए।

(Transfer each piece to another sterilized patridish. A white circular ring of cambium is found around the pith in each piece. Now cut a small piece of 4 mm2 area from each cross section through cambium so that phloem, cambium and xylem can include in this small piece. The size and thickness of the explants should be uniform.)

·         प्रत्येक बदलाव के पश्चात पेट्रीडिश के ढक्कन को प्रतिस्थापित कर देते हैं।

(After each change the lid of the patridish is replaced.)

·         संवर्धन ट्यूब से कॉटन प्लग को हटाकर इसके खुले सिरे के 20 mm ऊपरी भाग को ज्वाला से गर्म करते हैं। ट्यूब को ज्वाला पर 45° के कोण पर पकड़कर चिमटी की सहायता से एक कर्तोतक को अगर माध्यम की सतह पर स्थापित कर देते हैं। संवर्धन के लिए गैम्बर्ग का B5 माध्यम या MS माध्यम का उपयोग करते हैं जिसमें 0.5 mg/L 2,4-D मिश्रित किया गया हो।

(Remove the cotton plug from the culture tube and heat the top 20 mm of its open end with a flame of sprit lamp. Hold the tube at an angle of 45 ° on the flame and place an explant on the surface of the agar with the help of forceps. For culturing use Gamberg's B5 medium or MS medium containing 0.5 mg / L 2,4-D.)

·         अब प्रत्येक ट्यूब के खुले मुख को तुरन्त कॉटन प्लग से बन्द कर देते हैं। चिमटी को हमेशा उपयोग से पहले व बाद में ज्वाला से गर्म करना चाहिए। ग्लास मार्किंग पेन से प्रत्येक संवर्धन ट्यूब पर दिनांक, माध्यम व पौधे का नाम लिखना चाहिए।

(Now immediately close the open mouth of each culture tube with a cotton plug. Forceps should always be heated by flame before and after use. The date, medium and plant name should be written on each culture tube with a glass marking pen.)

·         अब इन संवर्धन ट्यूब्स को संवर्धन कक्ष में अंधेरे में रखकर 25°C ताप पर ऊष्मायन करते हैं।

(Now incubate these culture tubes in the culture chamber at 25 ° C by placing them in the dark.)

·         4 सप्ताहों पश्चात प्रत्येक संवर्धन ट्यूब में कर्तोतक से कैलस विकसित हो जाता है। प्रत्येक कैलस को निर्जमित पेट्रीडिश में स्थानांतरित करते हैं और चाकू की सहायता से 2 – 3 टुकड़ों में विभाजित कर लेते हैं।

(After 4 weeks, the callus develops from explant in each culture tube. Transfer each callus to sterilized patridish and divide it into 2 - 3 pieces with the help of a knife.)

·         अब कैलस ऊतक के प्रत्येक टुकड़े को ताजा माध्यम युक्त नयी ट्यूब में स्थापित करके उप संवर्धन करते हैं।

(Now sub-culture the each piece of the callus tissue by placing it in a new culture tube containing fresh medium.)

·     गाजर ऊतक के लम्बे समय तक रखे गए संवर्धन बड़े कैलस उत्पन्न करते हैं।

(Prolonged cultures of carrot tissue produce large callus.)

5. महत्व (Significance):-

·         कैलस ऊतक से बड़ी संख्या में सम्पूर्ण पौधों का निर्माण किया जा सकता है।

(A large number of whole plants can be developed from the callus tissue.)

·         कैलस ऊतक की कायिक कोशिकाओं से कायिक भ्रूण विकसित किए जा सकते हैं।

(Somatic embryos can be developed from the somatic cells of the callus tissue.)

·         कैलस ऊतक आनुवांशिक विविधता का अच्छा स्त्रोत होता है। इसलिए कैलस ऊतक की आनुवांशिक रूप से विविध कोशिकाओं से एक पौधे का निर्माण करना संभव हो सकता है।

(Callus tissue is a good source of genetic diversity. Therefore it may be possible to develop a plant from genetically diverse cells of callus tissue.)

·         गतिक द्रव माध्यम में कोशिका निलंबन संवर्धन कैलस ऊतक से प्रारम्भ किया जा सकता है।

(Cell suspension culture in dynamic liquid medium can be initiated from the callus tissue.)

·         औधौगिक रूप से महत्वपूर्ण द्वितीयक मेटाबोलाइट्स को प्राप्त करने के लिए कैलस संवर्धन बहुत उपयोगी है। उदाहरण के लिए किसी औषधीय पौधे का कैलस संवर्धन कराया जाए तो द्वितीयक मेटाबोलाइट या औषधि को सीधे कैलस ऊतक से प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रकार यह विकल्पी तकनीक प्रकृति में औषधीय पौधों के संरक्षण में सहायता करती है।

(Callus culture is very useful for obtaining industrially important secondary metabolites. For example, if a callus culture of a medicinal plant is developed, the secondary metabolite or drug can be obtained directly from the callus tissue. Thus, this alternative technique helps in conservation of medicinal plants in nature.)

·         अनेक जैव रासायनिक परीक्षण कैलस संवर्धन से किए जाते हैं।

(Many biochemical tests can be done with the help of callus culture.)