Cell Suspension Culture
UPDATED ON:- 01-07-2023
Cell Suspension Culture (कोशिका निलम्बन संवर्धन):-
1. परिभाषा (Definition):-
· जब एकल कोशिकाओं को द्रवित माध्यम में संवर्धित किया जाता है तो कोशिकाएं माध्यम में डूबी हुई अवस्था में संवर्धित होती हैं। इसे कोशिका निलम्बन संवर्धन कहते हैं।
(When single cells are cultured in a liquid medium, the cells are cultured in a submerged state in the medium. This is called cell suspension culture.)
· इसे कोशिका संवर्धन भी कहते हैं।
(It is also called cell culture.)
2. सिद्धान्त (Principle):-
· कैलस कोशिकाओं के असंगठित समुह के रूप में परिवर्धित होता है। इसलिए इसकी वृद्धि व विकास अवस्थाओं के दौरान अनेक कोशिकीय प्रक्रियाओं का अनुसरण करना बहुत कठिन होता है।
(Callus grows as an unorganized group of cells. Therefore it is very difficult to follow many cellular processes during its growth and development stages.)
· कैलस संवर्धन की उपरोक्त सीमाओं से बचने के लिए स्वतंत्र कोशिकाओं व छोटे कोशिकीय समुहों का रासायनिक रूप से परिभाषित द्रव माध्यम में निलंबन के रूप में संवर्धन शुरू हुआ। इससे उनकी वृद्धि व विकास अवस्थाओं के दौरान आकारिकीय व जैव रासायनिक परिवर्तनों का अध्ययन आसान हो गया।
(To avoid the above limitations of callus culture, culturing of free cells and small cell masses in a chemically defined liquid medium began as a suspension. This made the study of morphological and biochemical changes easier during their growth and development stages.)
· एक आदर्श कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए अधिकतर एक भुरभुरे कैलस को उत्तेजित द्रव माध्यम में स्थानांतरित करते हैं जहाँ यह टूटकर तीव्रता से फैल जाता है।
(To obtain an ideal cell suspension, mostly a fragile callus is transferred into a stimulated liquid medium where it breaks down and spreads rapidly.)
· बड़े कैलस टुकड़ों को निकालने के पश्चात केवल एकल कोशिकाओं व छोटे कोशिका समुहों को फिर से ताजा माध्यम में स्थानांतरित करते हैं। 2 – 3 सप्ताहों के पश्चात सक्रिय रूप से वृद्धि कर रही कोशिकाओं का निलंबन उत्पन्न होता है।
(After removing the larger callus pieces, only the single cells and small cell masses are again transferred to the fresh medium. After 2–3 weeks suspension of actively growing cells is produced.)
· इस निलंबन को नए ताजा माध्यम में उप संवर्धन के द्वारा प्रवर्धित किया जा सकता है। आदर्श रूप से निलंबन संवर्धन में केवल एकल कोशिकाएं होनी चाहिए जो कार्यिकीय व जैव रासायनिक रूप से एक समान हों।
(This suspension can be propagated by sub-culturing in new fresh medium. Ideally suspension culture should consist of only single cells that are physiologically and biochemically identical.)
3. इतिहास (History):-
· W. H. Muir (1953):- इसने सबसे पहले यह देखा कि कैलस के खण्डों को कोशिका निलंबन के रूप में संवर्धित किया जा सकता है।
(He first observed that pieces of the callus could be cultured as cell suspension.)
· Nickell (1956):- इसने सबसे पहले देखा कि Phaseolus vulgaris के कोशिका निलंबन संवर्धन को सतत रूप से अनुरक्षित किया जा सकता है।
(He first observed that cell suspension culture of Phaseolus vulgaris could be maintained continuously.)
· F. C. Steward व E. M. Shantz (1956):- इसने पादप की मूल या जड़ का निलंबन संवर्धन तैयार किया तथा बहुत अधिक संख्या में नए पौधे प्राप्त किए।
(They prepared suspension culture of the plant root and obtained a large number of new plants.)
4. विधि (Procedure):-
· 150 या 250 ml कोनिकल फ्लास्क लेकर इसमें 40 – 60 ml ऑटोक्लेवित द्रव माध्यम डालते हैं।
(Take 150 or 250 ml conical flask and put 40 - 60 ml autoclaved liquid medium in it.)
· अब एक चमचनुमा स्पैचुला की सहायता से पूर्व स्थापित कैलस के 1 – 1 gm के 3 – 4 टुकड़े संवर्धन ट्यूब से निकालकर कोनिकल फ्लास्क में स्थानांतरित करते हैं।
[Now take a callus from the culture tube and cut 3 - 4 pieces of callus (each of 1gm) with the help of a spoony spatula, and transfer them into the liquid medium in a conical flask.]
· अब कोनिकल फ्लास्क की गर्दन को ज्वाला से गर्म करते हैं तथा ऐलुमिनियम फोइल व कॉटन प्लग से फ्लास्क के मुख को बन्द कर देते हैं।
(Now heat the neck of the conical flask with flame of sprit lamp and close the mouth of the flask with cotton plug and aluminum.)
· अब इन कोनिकल फ्लास्कों को घूर्णन विलोडक के क्लैम्पों में फिट करके 80 – 120 RPM पर घुमाते हैं।
(Now fit these conical flasks into the clamps of the rotating shaker and shake them at 80 - 120 RPM.)
· 7 दिन के पश्चात प्रत्येक फ्लास्क के पदार्थ को 60 – 100 µm छिद्र आकार वाली निर्जमित छलनी से छानते हैं तथा छनित को एक बड़े निर्जमित पात्र में एकत्रित कर लेते हैं। इस छनित में केवल स्वतंत्र कोशिकाएं व छोटे कोशिकीय समुह उपस्थित होते हैं।
(After 7 days, the content of each flask is sieved with an sterilized sieve of 60 - 100 µm pore size and collect the filtrate in a large sterilized vessel. Only free cells and small cellular masses are present in this filtrate.)
· 10 – 15 मिनट के लिए छनित को स्थिर होने देते हैं अथवा 500 – 1000 RPM पर सेंट्रीफ्यूज करते है। अधिप्लावी को त्याग देते हैं।
(Allow the filtrate to stabilize for 10 - 15 minutes or centrifuge at 500 - 1000 RPM. Discard the supernatent.)
· अब शेष बची कोशिकाओं को ताजा द्रव माध्यम में पुन: निलंबित करते हैं। अब इस कोशिका निलंबन को 150 – 250 ml के अनेक फ्लास्कों में डालकर बराबर बाँट लेते हैं। अब इन फ्लास्कों को विलोडक पर रखते हैं और स्वतंत्र कोशिकाओं व कोशिका समुहों को वृद्धि करने देते हैं।
(Now re-suspended the remaining cells in fresh liquid medium. Now divide this cell suspension equally into several 150 or 250 ml flasks. Now place these flasks on the shaker and allow growth of free cells and cell masses.)
· अगले उप संवर्धन पर पूर्व के चरणों को दोहराते हैं परन्तु शेष बची कोशिकाओं का केवल 1/5 भाग इनोकुलम के रूप में लेकर बराबर फ्लास्कों में बाँट देते हैं और इन्हें फिर विलोडक पर रखते हैं।
(On the next sub-culture repeat the previous steps but take only 1/5 of the remaining cells as inoculum and divide them into equal flasks and then place them on the shaker.)
· 3 – 4 उप संवर्धनों के पश्चात प्रत्येक फ्लास्क में से 10 ml नए फ्लास्क में डालते हैं जिसमें पहले से 30 ml द्रव माध्यम उपस्थित हो।
(After 3 - 4 sub-cultures, 10 ml of each flask is poured into a new flask that already contains 30 ml of liquid medium.)
· निलंबन में कोशिकाओं का वृद्धि वक्र बनाने के लिए हीमोसाइटोमीटर द्वारा मापी गयी कोशिकाओं की एक निश्चित संख्या को द्रव माध्यम के एक निश्चित आयतन में स्थानांतरित करके विलोडक पर ऊष्मायन करते हैं।
(To create the growth curve of the cells in suspension, a certain number of cells are measured by hemocytometer and transferred into a certain volume of liquid medium and then incubated on the shaker.)
· 1 – 2 दिन के छोटे समय अंतराल पर पिपेट की सहायता से कोशिका संवर्धन की बहुत छोटी मात्रा लेकर उसमें कोशिकाओं की संख्या को गिनते हैं। कोशिका संख्या डाटा को ग्राफ पेपर पर बनाते हैं और इस प्रकार बना वक्र निलंबन संवर्धन के वृद्धि पैटर्न को दर्शाता है।
(Take very small amount of cell culture with the help of pipette at small intervals of 1 - 2 days and count the number of cells. The cell number data are drawn on graph paper and the curve thus formed shows the growth pattern of suspension culture.)
5. प्रकार (Types):- यह दो प्रकार का होता है -
(It is of 2 types -)
a. बैच संवर्धन (Batch Culture)
b. सतत संवर्धन (Continuous Culture)
a. बैच संवर्धन (Batch Culture):-
• परिभाषा (Definition):-
जब कोशिकाओं को द्रवित माध्यम की एक निश्चित मात्र में संवर्धित किया जाता है, तो एक निश्चित समय पर जाकर संवर्धन रुक जाता है। इसे बैच संवर्धन कहते हैं।
(When cells are cultured in a certain amount of liquid medium, the culture stops at a certain time. This is called batch culture.)
• इसे उप संवर्धन द्वारा सतत रूप से अनुरक्षित किया जा सकता है।
(It can be maintained continuously by sub-culturing.)
• इसे कोनिकल फ्लास्क में अनुरक्षित किया जाता है जिसे 80 – 120 RPM स्पीड से घूमते ओर्बिटल प्लेटफॉर्म शेकर पर ऊष्मायन किया गया हो।
(It is maintained in a conical flask incubated on an orbital platform shaker rotating at 80 - 120 RPM speed.)
• यह एक बंद तंत्र है जिसमे ऊष्मायन के समय न तो पोषक पदार्थ मिलाये जाते हैं और न ही अपशिष्ट पदार्थ निकाले जाते हैं।
(It is a closed system in which neither nutrients are added nor waste materials are extracted during incubation.)
• इसमें S – आकृति का ग्राफ प्राप्त होता है। इसमें कोशिकाएं निम्न 3 अवस्थाओं से होकर गुजरती हैं:-
(In this, S-shape graph is obtained. cells pass through the following 3 stages: -)
Ø Lag phase:- इसमें कोशिकाएं विभाजन के लिए तैयार होती हैं।
(In this, the cells are prepared for division.)
Ø Exponential phase:- इसमें कोशिकाओं के विभाजन की दर उच्चतम हो जाती है। कोशिकाओं की संख्या व आकार लगातार बढ़ते जाते हैं।
(In this, the rate of cell division highest. The number and size of cells increases continuously.)
Ø Stationary Phase:- कोशिका विभाजन रुक जाता है। कोशिकाओं की संख्या व आकार स्थिर हो जाते हैं।
(Cell division stops in this phase. The number and size of cells remain constant.)
• बैच संवर्धन के प्रकार (Types of Batch Culture):-
i. Slow Rotating Culture (धीमा घूर्णन संवर्धन)
ii. Shaker Culture (शेकर संवर्धन)
iii. Spinning Culture (स्पिनिंग संवर्धन)
iv. Stirred Culture (विलोडक संवर्धन)
b. सतत संवर्धन (Continuous Culture):-
• परिभाषा (Definition):-
जब समय समय पर पुराने माध्यम को नए माध्यम के द्वारा प्रतिस्थापित कर दिया जाता है तो संवर्धन लगातार बिना रुके चलता रहता है। इसे सतत संवर्धन कहते हैं।
(When the old medium is time to time replaced by the new medium, the culture remain continues without stopping. This is called continuous culture.)
• इस संवर्धन में कभी भी पोषक तत्वों की कमी नहीं होती है क्योंकि बाहर से लगातार इनकी सप्लाई दी जाती है। उत्पाद को समय समय पर बाहर निकालते रहते हैं। इस प्रकार संवर्धन लगातार चलता रहता है।
(There is never a shortage of nutrients in this culture because they are continuously supplied from outside. The product is taken out time to time. Thus the culture goes on continuously.)
• इसमें J – आकृति का ग्राफ प्राप्त होता है। अर्थात कोशिकाएं हमेशा तीव्र वृद्धि अवस्था में बनी रहती हैं।
(In this, a J-shape graph is obtained. That is, cells always remain in a exponential growth phase.)
· सतत संवर्धन के प्रकार (Types of Continuous Culture):- यह 2 प्रकार का होता है –
(It is of two types -)
i. बंद प्रकार (Closed Type):- इसमें पुराने माध्यम को ताजा माध्यम से प्रतिस्थापित किया जाता है। पुराने माध्यम से कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से पुन: प्राप्त कर ताजा माध्यम में डाल दिया जाता है। इस प्रकार कोशिका जैवभार एकदम से बढ़ जाता है।
(In this the old medium is replaced by fresh medium. The cells are mechanically retrieved from the old medium and put into fresh medium. In this way, the cell biomass increases immediately.)
ii. खुला प्रकार (Open Type):- इसमें दोनों कोशिकाओं व पुराने माध्यम को ताजा माध्यम से प्रतिस्थापित किया जाता है। इस प्रकार संवर्धन में स्थिर वृद्धि दर बनी रहती है। यह 2 प्रकार का होता है –
(In this, both cells and old medium are replaced by fresh medium. Thus, the growth rate remains stable in culture. It is of two types -)
Ø Chemostat Culture
Ø Turbidostat Culture
6. महत्व (Importance):-
· कोशिका संवर्धन से अनेक प्रक्रियाओं के बारे में जानकारी मिलती है जैसे –
(Cell culture provides information about many processes such as -)
i. कोशिका कार्यिकी (Cell Physiology)
ii. कोशिका जैव रसायन (Cell Biochemistry)
iii. कोशिकीय उपापचय क्रियाएँ (Cell Metabolic Events)
· एकल कोशिका से शुरू होकर भ्रूण व अंग के निर्माण के बारे में जानकारी प्राप्त होती है।
(Information is obtained about the development of embryo and organ starting from a single cell, .)
· कोशिका संवर्धन के द्वारा उत्परिवर्तित कोशिका क्लोन्स विकसित करके उत्परिवर्तित पौधे विकसित किए जा सकते है। इससे उत्परिवर्तन को समझने में सहायता मिलती है।
(Mutated plants can be developed by developing mutated cell clones through cell culture. This helps in understanding the mutation.)
7. लाभ (Advantages):-
· पोषक पदार्थों को लगातार समायोजित किया जा सकता है।
(Nutrients can be adjusted continuously.)
· इसके उपयोग से कोशिकाओं को बहुत बड़े स्तर पर उत्पन किया जा सकता है।
(Using this, cells can be produced on a very large scale.)
· एकल पादप कोशिका से सम्पूर्ण पादप का निर्माण किया जा सकता है। इसे पूर्णशक्तता कहते हैं।
(The whole plant can be developed from a single plant cell. This is called totipotency.)
8. हानियाँ (Disadvantages):-
· उप संवर्धन काल के लंबा होने पर कोशिका संवर्धन की उत्पादकता कम होती जाती है।
(The productivity of cell culture decreases as the sub-culturing period is prolonged.)
· पादप कोशिकाओं की वृद्धि धीमी होती है और उत्पादकता कम होती है।
(Plant cell growth is slow and productivity is low.)
· पादप ऊतकों को काटने से कोशिकाएं क्षतिग्रस्त हो सकती हैं।
(Cells can be damaged during the cutting of plant tissue.)