Pollen Culture
परागकण संवर्धन (Pollen Culture):-
1. परिचय (Introduction):-
· परिभाषा (Definition):-
परागकण या लघुबीजाणु संवर्धन एक कृत्रिम प्रक्रिया है जिसमें निर्जमित परिस्थितियों में परागकण या लघुबीजाणु को इसकी एककेन्द्रकी अवस्था पर साबुत परागकोष से निकाला जाता है और पोषक माध्यम पर संवर्धित किया जाता है।
(Pollen grain or microspore culture is an artificial process in which pollens or microspores are extracted from the intact anther at its uni-nucleated state and cultured on the nutrient medium under sterilized conditions.)
· एंड्रोजेनेसिस (Androgenesis):- पूर्णशक्त परागकण से कोशिका विभाजन व विभेदन की श्रंखला द्वारा अगुणित पौधों के कृत्रिम रूप से विकसित होने की प्रक्रिया को एंड्रोजेनेसिस कहते हैं। यह 2 प्रकार का होता है –
(The process of artificial development of haploid plants by a series of cell division and differentiation from a totipotent pollen is called androgenesis. It is of two types -)
i. प्रत्यक्ष एंड्रोजेनेसिस (Direct Androgenesis):-
लघुबीजाणु जाइगोट के समान व्यवहार करता है तथा कुछ परिवर्तनों द्वारा भ्रूण समान संरचना का निर्माण करता है जो आगे अगुणित पौधे में विकसित हो जाता है। इसे भ्रूणजनन कहते हैं।
(The microspore behaves like a zygote and by some changes the it forms a embryo like structure which further develops into haploid plants. This is called embryogenesis.)
ii. अप्रत्यक्ष एंड्रोजेनेसिस (Indirect Androgenesis):-
लघुबीजाणु बार बार विभाजित होकर कैलस ऊतक का निर्माण करता है। इसमें विभेदन होने से अगुणित पौधा बन जाता है। इसे अंगजनन कहते हैं।
(The microspore divides repeatedly to form the callus tissue. Differentiation leads to development of haploid plant. This is called organogenesis.)
2. सिद्धान्त (Principle):-
· लघुबीजाणु की पूर्णशक्तता के उपयोग से अगुणित पौधे का निर्माण किया जाता है।
(The haploid plant is developed using the totipotency of the microspore.)
· लघुबीजाणु में गुणसूत्रों का केवल एक समुचय उपस्थित होता है।
(Only one set of chromosomes is present in the microspore.)
· अगुणित पादप निर्माण की प्रक्रिया में लघुबीजाणु का नर युग्मक निर्माण का सामान्य विकास व कार्य रुक जाता है। कायिक कोशिका विभाजन के लिए इसे बलपूर्वक नए उपापचय पथ की ओर मोड़ दिया जाता है।
(In the process of haploid plant development, the normal development and function of the microspore of the male gametes formation stops. It is forced into a new metabolic pathway for somatic cell division.)
· परागकोष संवर्धन में परागकोष की द्विगुणित कायिक कोशिकाएं भी कभी कभी संवर्धन परिस्थितियों में सक्रिय हो जाती हैं और संवर्धित होकर अनचाहे द्विगुणित कैलस या प्लांटलेट्स का निर्माण करती हैं। कभी कभी काइमेरा बन जाता है। ऐसा कैलस या प्लांटलेट जिसकी कुछ कोशिकाएं अगुणित व कुछ कोशिकाएं द्विगुणित होती हैं, काइमेरा कहलाता है। इस समस्या से बचने परागकोषों से निकाले गए स्वतंत्र परागकणों को पोषक माध्यम पर संवर्धित किया जाता है।
(In pollen culture, diploid somatic cells of the anther also sometimes become active under culturing conditions and grow to form unwanted diploid callus or plantlets. Sometimes the chimera is formed. A callus or plantlet whose some cells are haploid and some cells are diploid, is called chimera. To avoid this problem, free pollens extracted from the anthers are cultured on the nutrient medium.)
3. विधि (Procedure):-
· पुष्पन पर तंबाकू की बन्द पुष्पीय कलिकाओं को एकत्रित करते हैं। 17 – 22 mm लंबाई की पुष्पीय कालिका का चयन करते हैं जब बाह्यदलों की लंबाई दलों की लंबाई के बराबर होती है। खुल रही सभी पुष्पीय कलिकाओं को त्याग देते हैं।
(Collect the closed floral buds of the tobacco upon flowering. A floral bud of length 17 - 22 mm is selected when the length of the sepals is equal to the length of the petals. Discards all opening floral buds.)
· चयनित पुष्पीय कलिकाओं को LAF कैबिनेट के अन्दर ले जाते हैं। प्रत्येक पुष्पीय कालिका में 5 परागकोष होते हैं और बन्द कलिकाओं के अन्दर इनकी सतह स्वत: निर्जमित होती है। पुष्पीय कलिकाओं के सतही निर्जमीकरण के लिए इन्हें पहले 10 सेकंड के लिए 70% ऐथेनोल में डुबोकर रखते हैं और फिर 10 मिनट के लिए 20% सोडियम हाइपोक्लोराइट विलयन में डुबोकर रखते हैं। अतिरिक्त रसायन को सतह से हटाने के लिए पुष्पीय कलिकाओं को निर्जमित आसुत जल से 3 बार धोते हैं। अंत में इन पुष्प कलिकाओं को निर्जमित पेट्रीडिश में स्थानांतरित कर देते हैं।
(Selected floral buds are carried inside the LAF cabinet. Each floral bud contain 5 anther and its surface is self sterilized within the closed buds. For surface sterilization of the floral buds, first dip them in 70% ethanol for 10 seconds and then in 20% sodium hypochlorite solution for 10 minutes. To remove excess chemicals from the surface, the floral buds are washed 3 times with sterilized distilled water. Finally these floral buds are transferred to the sterilized patridish.)
· अब एक तीखे चाकू के द्वारा कालिका के एक तरफ कट लगाते हैं और चिमटी की सहायता से दलों व बाह्यदलों को हटा देते हैं। अब एक अन्य चिमटी की सहायता से 5 पुंकेसरों को पुतन्तु सहित उखाड़कर एक अन्य निर्जमित पेट्रीडिश में स्थानांतरित करते हैं। अब 5 पुंकेसरों के पुतन्तुओं को चाकू या ब्लेड से काटकर अलग कर देते हैं जिससे केवल परागकोष रह जाते हैं। क्षतिग्रस्त परागकोषों को भी त्याग देते हैं।
(Now with a sharp knife, cut one side of the bud and remove the sepals and petals with the help of forceps. Now uproot 5 stamens along with filaments with the help of another forceps and transfer them to another sterilized patridish. Now cut the filaments of 5 stamens with a knife or blade, leaving only the anthers. Discard damaged anthers.)
· लगभग 50 परागकोषों को 20ml द्रव माध्यम युक्त एक छोटे निर्जमित बीकर में डालते हैं। द्रव माध्यम के रूप में MS या White या Nitsch का माध्यम ले सकते हैं।
(Almost 50 anthers are placed in a small sterilized beaker containing 20ml of liquid medium. MS or White or Nitsch medium can be used as the liquid medium.)
· अब एक निर्जमित ग्लास रोड की सहायता से परागकोषों को बीकर की आंतरिक दीवार के साथ दबाते हैं जिससे परागकण बाहर द्रव माध्यम में आ जाते हैं।
(Now the anthers are pressed along the inner wall of the beaker with the help of a sterilized glass road, bringing the pollen out into the liquid medium.)
· अब इन एकरूप परागकोषों को नायलोन की छलनी से छानते हैं जिससे परागकोष ऊतक के टुकड़े पृथक हो जाते हैं। शेष बचे छनित को अब परागकण निलंबन कहते हैं।
(Now these squeezed anthers are filtered with a nylon sieve, which separates the pieces of anthers. The remaining filtrate is now called pollen suspension.)
· अब इस परागकण निलंबन को 5 मिनट के लिए कम स्पीड (500 – 800 RPM) पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। अधिप्लवी में परागकोषों छोटे टुकड़े उपस्थित होते हैं इसलिए इसे त्याग देते हैं। परागकणों की पैलेट को ताजा द्रव माध्यम में निलंबित करते हैं।
(Now this pollen suspension is centrifuged at low speed (500 - 800 RPM) for 5 minutes. Small pieces of anthers are present in the supernatant, so discard it. The palette of pollens is suspended in fresh liquid medium.)
· सेंट्रीफ्यूगेशन व ताजा द्रव माध्यम में पुन: निलम्बन को दोहराकर 2 बार परागकणों को धो लेते हैं।
(After repeated centrifugation and suspended fresh liquid medium, pollens are washed twice.)
· अब एक 5cm पेट्रीडिश में द्रव माध्यम लेते हैं। पिपेट के उपयोग से 2.5ml परागकण निलम्बन लेकर ठोस द्रव माध्यम पर 5cm पेट्रीडिश में फैला देते हैं। परागकण द्रव माध्यम में बहुत अच्छी वृद्धि करते हैं, परन्तु यदि आवश्यक हो तो इन्हें प्लेटिंग के द्वारा बहुत कोमल अगार युक्त माध्यम पर भी उगाया जा सकता है। 1 ml परागकण निलम्बन में 103 से 104 तक परागकण होते हैं।
(Now take liquid medium in a 5cm patridish. Using a pipette, take 2.5ml pollen suspension and spread it on 5cm patridish on liquid medium. Pollens grow very well in the liquid medium, but they can also be grown on a very soft agar medium by plating, if necessary. 1 ml pollen suspension contain 103 to 104 pollens.)
· अब इन पेट्रीडिशों को इंक्यूबेटर में रखकर 27 – 30°C ताप पर ऊष्मायन किया जाता है। 16 घण्टे का प्रकाश व 8 घण्टे का अंधेरा दिया जाता है। प्रकाश की तीव्रता कम (500 लक्स) रखी जाती है।
[Now these petridishes are kept in incubator and incubate at 27 - 30 ° C temperature. 16 hours of light and 8 hours of darkness is given. Light intensity is kept low (500 lux).]
· 30 दिन के पश्चात तरुण भ्रूण समान संरचनाएं देखी जा सकती हैं।
(After 30 days young embryo like structures can be seen.)
· अब इन अगुणित भ्रूणो को नये ताजा अगार माध्यम पर संवर्धन ट्यूब में स्थापित करते हैं। इस अवस्था पर संवर्धनों का 24 – 28°C ताप पर ऊष्मायन किया जाता है। 14 घंटे का प्रकाश व 10 घंटे का अंधकार दिया जाता है। प्रकाश की तीव्रता 2000 लक्स रखी जाती है।
(Now these haploid embryos are placed in a culture tube on new fresh agar medium. At this stage the cultures are incubated at 24 - 28 ° C temperature. 14 hours of light and 10 hours of darkness are given. Light intensity is maintained at 2000 lux.)
· जब अगुणित प्लांटलेट्स की लंबाई 50 mm हो जाती है तो अगार माध्यम से स्वतंत्र करने के लिए नल के बहते हुए पानी में धोया जाता है। अब तुरन्त इन्हें औटोक्लेवित कम्पोस्ट युक्त छोटे गमलों में रोपित कर दिया जाता है। शुष्कन को रोकने के लिए प्रत्येक पौधे को काँच के बीकर से ढक देते हैं और आगे के परिवर्धन के लिए नम ग्रीन हाउस में रख देते हैं। कुछ सप्ताहों पश्चात काँच के बीकरों को हटा देते हैं और पौधों को मृदा युक्त बड़े गमलों में रोपित कर देते हैं जहाँ ये पौधे परिपक्व होकर अंत में पुष्पन करते हैं।
(When the length of haploid plantlets is 50 mm, they are washed in running water to free it from the agar medium. Now they are immediately planted in small pots with autoclaved compost. To prevent drying, cover each plant with a glass beaker and place it in a moist greenhouse for further growth. After a few weeks, the glass beakers are removed and the plants are planted in large pots containing soil where these plants mature and eventually flowering.)
4. लाभ (Advantages):-
· आधारभूत अनुसंधान के लिए परागकण संवर्धन की उपयोगिता (Utility of Pollen Culture for Basic Research)
· सरल (Simple)
· कम समय लेता है (Less Time Consuming)
· उत्तरदायी (Responsive)
· उत्परिवर्तन का अध्ययन (Mutation Study):-
Ø अगुणित पौधों में प्रत्येक जीन का केवल एक ही युग्मविकल्पी पाया जाता है। इसलिए कोई भी अप्रभावी उत्परिवर्तन या लक्षण स्पष्ट रूप से दिखाई देता हैं।
(In haploid plants, only one allele of each gene is found. Therefore any recessive mutation or trait are clearly visible.)
Ø घातक जीनों युक्त पौधे जीन पूल से निष्कासित हो जाते हैं।
(Plants containing lethal genes are expelled from the gene pool.)
Ø इस प्रकार उत्परिवर्तन का अध्ययन आसानी से किया जा सकता है।
(Thus mutation can be studied easily.)
· क्रायोजेनिक अध्ययन के लिए अगुणितों का उपयोग (Use of Haploids for Cryogenic Study)
· पादप प्रजनन व फसल सुधार के लिए उपयोग (For Plant Breeding and Crop Improvement):-
Ø समयुग्मजी वंशक्रमों को उत्पन्न किया जा सकता है। इसके लिए अगुणित पौधों को कोल्चिसीन रसायन से उपचारित किया जाता है।
(Homozygous lines can be produced. For this, haploid plants are treated with colchicine chemical.)
Ø उत्परिवर्तन प्रजनन विधि का उपयोग फसल सुधार में किया जाता है।
(Mutation breeding method is used in crop improvement.)
· बागवानी पौधों के लिए अगुणित संवर्धन का अनुप्रयोग (Application of Haploid Culture for Horticultural Plants)
· द्वितीयक मेटाबोलाइट्स के अध्ययन के लिए (For Study of Secondary Metabolites Content)
5. हानियाँ (Disadvantages):-
· बिना क्षति पहुंचाए परागकोषों व परागकणों को निकालने के लिए कौशल की आवश्यकता होती है।
(Skill is required to remove anthers and pollens without damaging them.)
· धान्य फसलों में यह बहुत अधिक सफल विधि नहीं है।
(This is not a very successful method in cereal crops.)
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