Brief account of protoplast culture and fusion

Somatic Hybridization (कायिक संकरण):- The process of obtaining hybrid plants by fusion of protoplasts of two different species or varieties, is called somatic hybridization. It has 3 main steps -

(दो भिन्न जातियों अथवा किस्मों के प्रोटोप्लास्टों के संलयन से संकर पौधे प्राप्त करने की प्रक्रिया को कायिक संकरण कहते हैं। इसके 4 मुख्य चरण होते हैं –)

1. Protoplast Isolation (प्रोटोप्लास्ट पृथक्करण)

2. Protoplast Fusion (प्रोटोप्लास्ट संलयन)

3. Protoplast Culture (प्रोटोप्लास्ट संवर्धन)

1. Protoplast Isolation (प्रोटोप्लास्ट पृथक्करण):- It has 2 main steps -

(इसके 2 मुख्य चरण हैं –)

a. Sterilization of Leaf (पर्ण का निर्जमीकरण)

b. Enzyme Treatment (एन्जाइम उपचार)

a. Sterilization of Leaf (पर्ण का निर्जमीकरण):- Soak the leaf in 70% ethanol for 1 minute. After this, keep this leaf in 2% NaOCl solution for 20 to 30 minutes. Now wash this leaf with distilled water for 3 minutes.

(पर्ण को 1 मिनट के लिए 70% एथेनॉल में डुबोकर रखते हैं। इसके पश्चात इस पर्ण को 20 से 30 मिनट के लिए 2% NaOCl विलयन में डुबोकर रखते हैं। अब इस पर्ण को 3 मिनट तक आसुत जल से धो लेते हैं।)

b. Enzyme Treatment (एन्जाइम उपचार):- Now this sterilized leaf is treated with 2 enzymes, pectinase and cellulase, respectively. The pectinase enzyme disintegrates the middle lamella. Cellulase enzymes decompose the cell wall. As a result protoplasts are obtained. To increase osmotic concentration, add 500 - 800 ml / L of sorbitol or mannitol.

(अब इस निर्जमित पर्ण को क्रमश: 2 एंजाइमों पेक्टीनेज व सेलुलेज से उपचारित कराया जाता है। पेक्टीनेज एन्जाइम मध्य पटलिका को विघटित कर देता है। सेलुलेज एन्जाइम कोशिका भित्ति को विघटित कर देता है। इसके फलस्वरूप प्रोटोप्लास्ट प्राप्त होते हैं। परासरणी सान्द्रता को बढ़ाने के लिए 500 – 800 ml/L सोर्बिटोल या मैनीटोल मिला देते हैं।)

2. Protoplast Fusion (प्रोटोप्लास्ट संलयन):- For this, 2 different protoplast samples are mixed together. Now Fusogen is added to this mixture which induces protoplast fusion.

(इसके लिए 2 अलग – अलग प्रोटोप्लास्ट नमूनों को एक साथ मिश्रित किया जाता है। अब इस मिश्रण में Fusogen मिलाया जाता है जो प्रोटोप्लास्ट संलयन को प्रेरित करता है।)

 

One of the following factors can be used as Fusogen -

(Fusogen के रूप में निम्न में से किसी एक कारक का उपयोग कर सकते हैं –)

i. PEG (Poly Ethylene Glycol)

ii. High pH + Ca²⁺

iii. NaNO₃

iv. Electric Pulse

At the end of this step, 3 types of products are obtained -

(इस चरण के अन्त में 3 प्रकार के उत्पाद प्राप्त होते हैं –)

i. Homokaryon

ii. Heterokaryon

iii. Unfused protoplasts

3. Protoplast Culture (प्रोटोप्लास्ट संवर्धन):-

Ø  Isolated hybrid protoplast cells are proliferated on solid MS-medium in patridishes.

(पृथक्कृत संकर प्रोटोप्लास्ट कोशिकाओं को पेट्रीडिश में ठोस MS – माध्यम पर संवर्धित करते है।)

Ø  Osmaticum:- It is a substance that acts to increase the osmotic concentration. It is added to both enzyme mixture and culture medium. The protoplast requires osmotic protection during isolation and culture because the cell wall has not yet been formed. One of the following can be used as osmaticum -

(यह ऐसा पदार्थ होता है जो परासरण सांद्रता को बढ़ाने का कार्य करता है। इसे एंजाइम मिश्रण व संवर्धन माध्यम दोनों में डाला जाता है। पृथक्करण व संवर्धन के दौरान प्रोटोप्लास्ट को परासरणी सुरक्षा की आवश्यकता पड़ती है क्योंकि अभी तक कोशिका भित्ति का निर्माण तो हुआ नहीं होता है। Osmaticum के रूप में निम्न में से किसी एक का उपयोग कर सकते है -)

i. Sorbitol (सोर्बिटोल)

ii. Manitol (मैनीटोल)

iii. Glucose (ग्लूकोज)

iv. Sucrose (सुक्रोज)

Ø  Cover the patridish with a lid and seal it with paraffin wax so that the medium does not dry at 40ºC.

(पेट्रीडिश को ढक्कन द्वारा ढककर पैराफीन वैक्स से सील कर देते हैं ताकि 40ºC पर माध्यम का शुष्कन न हो।)

Ø  Now transfer this patridish to the incubator where the temperature is 25 - 28ºC and the light intensity is 2300 lux.

(अब इस पेट्रीडिश को इंक्यूबेटर में स्थानांतरित करते हैं जहां तापमान 25 – 28ºC और प्रकाश की तीव्रता 2300 लक्स रखे जाते हैं।)

Ø  Cell wall formation starts after a few hours. The first cell division occurs after 2–7 days.

(कुछ घण्टों के पश्चात कोशिका भित्ति निर्माण शुरू हो जाता है। 2 – 7 दिनों के पश्चात पहला कोशिका विभाजन होता है।)

Ø  Multicellular groups are formed after 2–3 weeks.

(2 – 3 सप्ताहों के पश्चात बहुकोशिकीय समूह बन जाते हैं।)

Ø  Now these cellular groups are transferred to a medium free of osmaticum so that callus or embryo can develop.

(अब इन कोशिकीय समूहों को osmaticum रहित माध्यम में स्थानांतरित करते हैं ताकि कैलस या भ्रूण का विकास हो सके।)

Ø  Further differentiation leads to organogenesis and development of hybrid plants.

(और अधिक विभेदन से अंगजनन होता है और संकर पौधों का निर्माण हो जाता है।)