Principles and use of instrument and technique for centrifugation

Basic Principle of Centrifugation (सेंट्रीफ्यूगेशन का सामान्य सिद्धान्त):- The centrifuge works on the principle of gravity and the generation of the centrifugal force to sediment different fractions. The rate of sedimentation depends on the applied centrifugal field (G) which is directed radially outwards. G depends on-

[सेंट्रीफ्यूग गुरुत्वाकर्षण के सिद्धांत पर कार्य करता है और विभिन्न अंशों के अवसादन के लिए अपकेन्द्री बल उत्पन्न करता है। अवसादन की दर लगाए गए अपकेन्द्री क्षेत्र (G) पर निर्भर करती है जो त्रिज्यीय रूप से बाहर की ओर निर्देशित होता है। G निम्न कारकों पर निर्भर करता है-]

i. Angular velocity (ω in radians/sec)

[कोणीय वेग (ω रेडियन्स / सेकण्ड में)]

ii. Radial distance (r in cm) of the particle from the axis of rotation

[घूर्णन अक्ष से कण की त्रिज्यीय दूरी (r सेमी में)]

G = ω²r

Rate of sedimentation (अवसादन की दर):- It depends on factors other than centrifugal force like the mass of the particle, density and volume, the density of the medium, shape of the particle, and friction.

(यह अपकेन्द्री बल के अतिरिक्त अन्य कारकों पर भी निर्भर करती है जैसे कण का द्रव्यमान, घनत्व और आयतन, माध्यम का घनत्व, कण की आकृति और घर्षण।)

Sedimentation time (अवसादन समय):- It depends on the following factors and they are-

(यह निम्नलिखित कारकों पर निर्भर करता है-)

i. Size of particle

(कण का आकार)

ii. The density difference between  particle and medium

(कण और माध्यम के बीच घनत्व अंतर)

iii. Radial distance from the axis of rotation to the liquid meniscus (rt)

[घूर्णन अक्ष से तरल सतह तक त्रिज्यीय दूरी (rt)]

iv. Radial distance from the axis of rotation to the bottom of the tube(rb)

[घूर्णन अक्ष से परखनली के तल तक त्रिज्यीय दूरी (rb)]

v. Revolutions Per Minute (RPM)

[प्रति मिनट घूर्णन (RPM)]

Types of Centrifuge (सेंट्रीफ्यूज के प्रकार):- 

1. Low speed centrifuge (निम्न गति सेंट्रीफ्यूज):-

> Most laboratories have a standard low-speed centrifuge used for routine sedimentation of heavy particles.

(अधिकांश प्रयोगशालाओं में भारी कणों के नियमित अवसादन के लिए एक मानक निम्न गति सेंट्रीफ्यूज होता है।)

> The low-speed centrifuge has a maximum speed of 4000-5000 RPM.

(इसकी अधिकतम गति 4000-5000 RPM है।)

> These instruments usually operate at room temperatures with no means of temperature control. 

(ये उपकरण आमतौर पर तापमान नियंत्रण के किसी साधन के बिना कमरे के तापमान पर कार्य करते हैं।)

> Two types of rotors are used in it:

(इसमें दो प्रकार के रोटर्स का उपयोग किया जाता है:)

i. Fixed angle (स्थिर कोण)

ii. Swinging bucket (झूलती बाल्टी)

> It is used for sedimentation of red blood cells until the particles are tightly packed into a pellet and supernatant is separated by decantation.

(इसका उपयोग RBCs के अवसादन के लिए किया जाता है जब तक कि कण एक गोली के रूप में कसकर पैक नहीं हो जाते हैं और निक्षालक निस्तारण द्वारा अलग हो जाता है।)

2. High speed centrufuge (उच्च गति सेंट्रीफ्यूज):- 

> High-speed centrifuges are used in more sophisticated biochemical applications. Higher speeds and temperature control of the rotor chamber are essential.

(अधिक परिष्कृत जैव रासायनिक अनुप्रयोगों में उच्च गति वाले सेंट्रीफ्यूज का उपयोग किया जाता है। उच्च गति और रोटर कक्ष का तापमान नियंत्रण आवश्यक है।)

> The high-speed centrifuge has a maximum speed of 15,000 – 20,000 RPM.

(इसकी अधिकतम गति 15,000 - 20,000 RPM है।)

> The operator of this instrument can carefully control speed and temperature which is required for sensitive biological samples.

(इस उपकरण का संचालक सावधानीपूर्वक गति और तापमान को नियंत्रित कर सकता है जो संवेदनशील जैविक नमूनों के लिए आवश्यक होता है।)

> Three types of rotors are available for high-speed centrifugation-

(उच्च गति सेंट्रीफ्यूगेशन के लिए तीन प्रकार के रोटर उपलब्ध होते हैं-)

i. Fixed angle (स्थिर कोण)

ii. Swinging bucket (झूलती बाल्टी)

iii. Vertical rotors (ऊर्ध्वाधर रोटर्स)

3. Ultracentrifuges (अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज):- 

> It is the most sophisticated instrument.

(यह सबसे परिष्कृत उपकरण है।)

> Ultracentrifuge has a maximum speed of 65,000 RPM (100,000 x g).

(इसकी अधिकतम गति 65,000 RPM (100,000 x g) है।)

> Intense heat is generated due to high speed thus the spinning chambers must be refrigerated and kept at a high vacuum.

(उच्च गति के कारण अत्यधिक ऊष्मा उत्पन्न होती है इसलिए घूर्णन कक्षों को प्रशीतित किया जाना चाहिए और उच्च निर्वात में रखा जाना चाहिए।)

> It is used for both preparative work and analytical work.

(इसका उपयोग निर्माण कार्य और विश्लेषणात्मक कार्य दोनों के लिए किया जाता है।)

Types of Centrifugation (सेंट्रीफ्यूगेशन के प्रकार):- 

1. Differential centrifugation (विभेदक सेंट्रीफ्यूगेशन):-

> It is the most common type of centrifugation employed.

(यह उपयोग किया जाने वाला सेंट्रीफ्यूगेशन का सबसे आम प्रकार है।)

> Tissue such as the liver is homogenized at 32 degrees in a sucrose solution that contains buffer.

(यकृत जैसे ऊतक को सुक्रोज घोल में 32 डिग्री पर समरूप किया जाता है जिसमें बफर होता है।)

> The homogenate is then placed in a centrifuge and spun at constant centrifugal force at a constant temperature.

(समरूप मिश्रण को अब एक सेंट्रीफ्यूज में रखा जाता है और एक स्थिर तापमान पर निरंतर अपकेन्द्री बल पर घूमाते हैं।)

> After some time a sediment forms at the bottom of a centrifuge called pellet and an overlying solution called supernatant.

(कुछ समय बाद परखनली के तल पर एक अवसाद बनता है जिसे गोली कहा जाता है और निक्षालक नामक एक ऊपरी विलयन होता है।)

> The overlying solution is then placed in another centrifuge tube which is then rotated at higher speeds in progressing steps.

(इसके बाद ऊपरी विलयन को एक अन्य सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखा जाता है, जिसे बाद में बढ़ते चरणों में उच्च गति पर घुमाया जाता है।)

2. Density Gradient Centrifugation (घनत्व प्रवणता सेंट्रीफ्यूगेशन):- 

> This type of centrifugation is mainly used to purify viruses, ribosomes, membranes, etc.

(इस प्रकार के सेंट्रीफ्यूगेशन का उपयोग मुख्य रूप से वायरस, राइबोसोम, झिल्लियों आदि को शुद्धिकृत करने के लिए किया जाता है।)

> A sucrose density gradient is created by gently overlaying lower concentrations of sucrose on higher concentrations in centrifuge tubes.

(सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में उच्च सांद्रता पर सुक्रोज की कम सांद्रता को धीरे से डालकर एक सुक्रोज घनत्व प्रवणता बनाई जाती है।)

> The particles of interest are placed on top of the gradient and centrifuge in ultracentrifuges.

(वांछित कणों को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में प्रवणता व सेंट्रीफ्यूज के ऊपर डाला जाता है।)

> The particles travel through the gradient until they reach a point at which their density matches the density of surrounding sucrose.

(कण प्रवणता के माध्यम से तब तक यात्रा करते हैं जब तक वे उस बिंदु तक नहीं पहुंच जाते जहां उनका घनत्व आसपास के सुक्रोज के घनत्व से मेल खाता है।)

> The fraction is removed and analyzed.

(अंश को हटाया जाता है और उसका विश्लेषण किया जाता है।)

> 2 types - (2 प्रकार - )

i. Isopynic Centrifugation (आइसोपिकनिक सेंट्रीफ्यूगेशन):- 

- The sample is loaded into the tube with the gradient-forming solution.

(नमूने को ट्यूब में प्रवणता बनाने वाले विलयन के साथ लोड किया जाता है।)

- The solution of the biological sample and cesium salt is uniformly distributed in a centrifuge tube and rotated in an ultracentrifuge.

(जैविक नमूने और सीज़ियम लवण के विलयन को समान रूप से एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वितरित किया जाता है और एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में घुमाया जाता है।)

- Under the influence of centrifugal force, the cesium salts redistribute to form a density gradient from top to bottom.

(अपकेन्द्री बल के प्रभाव में, सीज़ियम लवण ऊपर से नीचे तक घनत्व प्रवणता बनाने के लिए पुनर्वितरित हो जाता है।)

- Particles move to point where their buoyant density equals that part of gradient and form bands. This is to say the sample molecules move to the region where their density equals the density of gradient.

(कण उस बिंदु पर जाते हैं जहां उनका उत्प्लावक घनत्व प्रवणता के उस भाग के बराबर होता है और बैंड बनाते हैं। अर्थात नमूना अणु उस क्षेत्र में जाते हैं जहां उनका घनत्व प्रवणता के घनत्व के बराबर होता है।)

- It is a “true” equilibrium procedure since depends on bouyant densities, not velocities.

Eg: CsCl, NaI gradients for macromolecules and nucleotides – “self-forming” gradients under centrifugal force.

(यह एक "सत्य" संतुलन प्रक्रिया है क्योंकि यह उत्प्लावक घनत्व पर निर्भर करता है, वेग पर नहीं।

उदाहरण- वृहद अणुओं व न्यूक्लियोटाइड्स के लिए CsCl, NaI प्रवणतायें:- अपकेन्द्री बल के अंतर्गत "स्वनिर्मित" प्रवणताएं।)

ii. Rate-Zonal Centrifugation (दर-क्षेत्रीय सेंट्रीफ्यूगेशन):-

- Zonal centrifugation is also known as band or gradient centrifugation.

(क्षेत्रीय सेंट्रीफ्यूगेशन को बैंड या प्रवणता सेंट्रीफ्यूगेशन के रूप में भी जाना जाता है।)

- It relies on the concept of sedimentation coefficient (i.e. movement of sediment through the liquid medium).

[यह अवसादन गुणांक की अवधारणा पर निर्भर करता है (अर्थात तरल माध्यम से अवसाद का संचलन)।]

- In this technique, a density gradient is created in a test tube with sucrose and high density at the bottom.

(इस तकनीक में, एक परखनली में सुक्रोज और तल पर उच्च घनत्व के साथ एक घनत्व प्रवणता बनाई जाती है।)

- The sample of protein is placed on the top of the gradient and then centrifuged.

(प्रोटीन का नमूना प्रवणता के शीर्ष पर रखा जाता है और फिर सेंट्रीफ्यूगेशन किया जाता है।)

- With centrifugation, faster-sedimenting particles in sample move ahead of slower ones i.e. sample separated as zones in the gradient.

(सेंट्रीफ्यूगेशन के साथ, सैंपल में तेजी से अवसादित कण धीमी गति से अवसादित कणों से आगे निकाल जाते हैं अर्थात नमूने को प्रवणता में क्षेत्रों के रूप में अलग किया जाता है।)

 - The protein sediment according to their sedimentation coefficient and the fractions are collected by creating a hole at the bottom of the tube.

(प्रोटीन उनके अवसादन गुणांक के अनुसार अवसादित होते हैं और ट्यूब के तल पर एक छिद्र बनाकर अंशों को एकत्रित कर लिया जाता है।)

Use of instrument and technique for centrifugation (उपकरण का उपयोग व सेंट्रीफ्यूगेशन की तकनीक):-

1. Preparing and Loading Samples (नमूने तैयार करना और लोड करना):-

i. Inspect centrifuge bottles and tubes for cracks before use. 

(उपयोग से पहले सेंट्रीफ्यूज बोतलों और ट्यूबों का दरारों के लिए निरीक्षण करते हैं।)

ii. Cap tubes with the proper lid.

(उचित ढक्कन से ट्यूब पर कैप लगाते हैं।)

iii. Wipe the outside of the tube with disinfectant before placing it in the centrifuge.

(सेंट्रीफ्यूज में रखने से पहले ट्यूब को बाहर से कीटाणुनाशी से पोंछ लेते हैं।)

iv. Clearly label tubes for identification.

(पहचान के लिए स्पष्ट रूप से ट्यूबों को लेबल कर लेते हैं।)

v. Make a counterbalance for the centrifuge tube you want to put in the centrifuge.

(आप जिस सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज में डालना चाहते हैं, उसके लिए एक काउंटरबैलेंस बनाते हैं।)

2. Using the Centrifuge (सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करना):-

> Place the centrifuge on a firm, level surface.

(सेंट्रीफ्यूज को एक फर्म, समतल सतह पर रखते हैं।)

> Choose the proper rotor to use at the speed you need. 

(आपको जिस गति की आवश्यकता है, उसका उपयोग करने के लिए उचित रोटर को चुनते हैं।)

> Load the tubes opposite each other in the centrifuge.

(सेंट्रीफ्यूज में एक दूसरे के विपरीत ट्यूबों को लोड करते हैं।)

> Enter the centrifugation speed.

(सेंट्रीफ्यूगेशन गति सैट करते हैं।)

> Keep a safe distance while the centrifuge is running.

(सेंट्रीफ्यूज के चलने के दौरान सुरक्षित दूरी बनाए रखते हैं।)

> Turn off the centrifuge if it is wobbling.

(सेंट्रीफ्यूज अगर डगमगा रही हो तो उसे बंद कर देते हैं।)

> Open the lid only after the rotor has completely stopped.

(रोटर के पूरी तरह बंद हो जाने के बाद ही ढक्कन को खोलते हैं।)

> Remove the tubes carefully after the centrifuge has completely stopped spinning.

(सेंट्रीफ्यूज के पूरी तरह से घूमना बंद कर देने के बाद ट्यूबों को ध्यानपूर्वक हटा लेते हैं।)

> Wipe down the rotor and centrifuge after each use.

(प्रत्येक उपयोग के बाद रोटर और सेंट्रीफ्यूज को साफ कर देते हैं।)