• PCR (Polymerase Chain Reactions / पॉलीमरेज श्रंखला अभिक्रियाएं):- The process of multiplication of DNA segments using DNA polymerase and DNA primers is called PCR.
(DNA पॉलीमरेज व DNA primers के उपयोग से DNA खण्डों के गुणन की प्रक्रिया को PCR कहते हैं।)
• Discovery (खोज):- The PCR technique was discovered by Kary Mullis in 1985.
(PCR तकनीक की खोज Kary Mullis ने 1985 में की थी।)
• Thermocyclers are used to achieve different temperatures.
(विभिन्न तापमानों को प्राप्त करने के लिए Thermocyclers का उपयोग किया जाता है।)
• PCR has three main steps -
(PCR में तीन मुख्य चरण होते हैं -)
i. Denaturation (विकृतिकरण):- When dsDNA is heated, both its chains separate at a temperature of 90°C.
(dsDNA को ऊष्मा देने पर 90°C तापमान पर इसकी दोनों श्रंखलायें अलग - अलग हो जाती हैं।)
ii. Primer Annealing (प्राइमर जोड़ना):- Primers are attached at the 5 'end of single chains at a temperature of 55°C.
(55°C तापमान पर Primers एकल श्रंखलाओं के 5' सिरे पर जुड़ जाते हैं।)
iii. Polymerization (बहुलकीकरण):- DNA polymerase enzyme polymerize the primers at 70°C temperature.
(70°C तापमान पर DNA polymerase एंजाइम Primers का बहुलकीकरण कर देते हैं।)
• Heat stable DNA polymerase (ताप स्थायी DNA पॉलीमरेज):-
Ø Normal DNA polymerase is heat sensitive. It is destroyed due to its deformation at 90°C temperature. Therefore, we cannot use normal DNA polymerase in PCR.
(सामान्य DNA पॉलीमरेज ताप संवेदी होता है। 90°C ताप पर इसका विकृतिकरण होने से यह नष्ट हो जाता है। इसलिए PCR में हम सामान्य DNA पॉलीमरेज का उपयोग नहीं कर सकते।)
Ø Instead, we use heat stable DNA polymerase in PCR which can tolerate high temperature and does not deform.
(इसकी बजाय PCR में हम ताप स्थायी DNA पॉलीमरेज का उपयोग करते हैं जो उच्च ताप को सहन कर सकते हैं व इसका विकृतिकरण नहीं होता है।)
Uses of PCR (PCR के उपयोग):-
i. The amplification of gene fragments as fast alternative of cloning.
(क्लोनिंग के तीव्र विकल्प के रूप में जीन खण्डों का प्रवर्धन।)
ii. The modification of DNA fragments.
(DNA खण्डों का रूपान्तरण।)
iii. The sensitive detection of pathogenic microorganisms, if desired followed by an accurate genotyping.
(रोगजनक सूक्ष्मजीवों की रोगजनकता का पता लगाना, यदि वांछित हो तो सटीक जीनोटाइपिंग करना।)
iv. DNA analysis of arachaeological specimens.
(पुरातात्विक नमूनों का DNA विश्लेषण।)
v. The detection of mutations relevant for inherited diseases, malignant transformation or tissue typing.
(वंशागत रोगों, घातक रूपांतरणों या ऊतक टाइपिंग के लिए प्रासंगिक उत्परिवर्तन का पता लगाना।)
vi. The analysis of genetic markers for forensic applications, for paternity testing and for the mapping of hereditary traits.
(फोरेंसिक अनुप्रयोगों के लिए, पितृत्व परीक्षण के लिए और वंशानुगत लक्षणों के मापन के लिए आनुवंशिक मार्करों का विश्लेषण।)
vii. The species-specific amplification of DNA segments between interspersed-repeat elements.
(अंतर्निहित पुनरावर्तित खण्डों के मध्य DNA खण्डों का प्रजाति-विशिष्ट प्रवर्धन।)
viii. The study of gene expression.
(जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन।)
Gene sequencing (जीन अनुक्रमण):-
> It is the process of determining the sequence of nucleotides in a piece of DNA.
(यह DNA के एक टुकड़े में न्यूक्लियोटाइड्स के अनुक्रम को निर्धारित करने की प्रक्रिया है।)
> Methods (विधियाँ):-
a. Maxam - Gilbert method (मैक्सम गिल्बर्ट विधि)
b. Sanger's method (सैंगर की विधि)
a. Maxam - Gilbert method (मैक्सम गिल्बर्ट विधि):-
- Also called as chemical cleavage method.
(इसे रासायनिक विदलन विधि भी कहते हैं।)
- Discovered by American molecular biologists Allan M. Maxam and Walter Gilbert in 1973.
(1973 में अमेरिकी आणविक जीवविज्ञानी Allan M. Maxam व Walter Gilbert द्वारा खोजी गई।)
Procedure (विधि):- The steps of Maxam Gilbert Sequencing are:
(मैक्सम गिल्बर्ट अनुक्रमण के चरण हैं:)
i. Radioactive labeling of the 5′ end by a kinase reaction using gamma-32P ATP and purification.
(गामा-32P ATP का उपयोग करके काइनेज अभिक्रिया द्वारा 5' सिरे की रेडियोसक्रिय लेबलिंग और शुद्धिकरण।)
ii. Four chemical Treatments for A+ G, G, C + T, C bases:-
(A+ G, G, C + T, C क्षारों के लिए चार रासायनिक उपचार:-)
- Depurination of purines (A+G) by formic acid
[फॉर्मिक अम्ल द्वारा प्यूरीन (A+G) को हटाना]
- Methylation of guanine (G) by dimethyl sulfate
[डाइमेथाइल सल्फेट द्वारा गुआनिन (G) का मेथाइलीकरण]
- Hydrolyzation of pyrimidines (C+T) by hydrazine
[हाइड्रेजीन द्वारा पिरिमिडीन (C + T) का हाइड्रोलाइज़ेशन]
- Inhibition of the hydrazine reaction for thymine (T) by the addition of sodium chloride, hydrolyzing only cytosine (C).
[सोडियम क्लोराइड के द्वारा थाइमिन (T) के लिए हाइड्रेजीन अभिक्रिया को रोकना, केवल साइटोसिन (C) को हाइड्रोलाइज करना।]
iii. Cleavage of the modified DNA by hot piperidine [(CH2)5NH] at the position of the modified base producing a series of labeled fragments from the radiolabeled end to the first ‘cut’ site.
[गर्म पिपिरीडीन [(CH2)5NH] द्वारा रूपांतरित क्षार की स्थिति पर काटकर DNA का विखंडन किया जाता है। इससे रेडियो लेबल टुकड़ों की एक श्रृंखला का निर्माण करता है।]
iv. Size fractionation of the fragments on a PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis).
[एक PAGE (पॉलीएक्रिलेमाइड जेल इलैक्ट्रोफोरेसिस) द्वारा इन खण्डों को आकार के अनुसार पृथक किया जाता है।]
v. Visualization by autoradiography, inferring the sequence.
(बैंड्स को देखने के लिए ऑटोरेडियोग्राफी की जाती है।)
b. Sanger's method (सैंगर की विधि):-
- Also called as dideoxy method.
(इसे डाइडिऑक्सी विधि भी कहा जाता है।)
- Discovered by English biochemist Frederick Sanger in 1977. He got Nobel Prize in Chemistry in 1980.
(1977 में अंग्रेजी जैवरसायनविज्ञ फ्रेडरिक सेंगर द्वारा खोजा गया। उन्हें 1980 में रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार मिला।)
Procedure (विधि):- The Sanger sequencing method consists of 6 steps:
(सेंगर अनुक्रमण विधि में 6 चरण होते हैं:)
i. The double-stranded DNA (dsDNA) is denatured into two single-stranded DNA (ssDNA).
[द्वि-रज्जुक DNA (dsDNA) को विकृतिकरण द्वारा दो एकल-रज्जुक DNA (ssDNA) में बदल दिया गया है।]
ii. A primer that corresponds to one end of the sequence is attached.
(अनुक्रम के एक छोर से संबंधित एक प्राइमर जुड़ जाता है।)
iii. Four polymerase solutions with four types of dNTPs but only one type of ddNTP are added.
(चार पोलीमरेज विलयन लेते हैं जिनमें चार प्रकार के dNTPs व केवल एक प्रकार का ddNTP डाला जाता है।)
iv. The DNA synthesis reaction initiates and the chain extends until a termination nucleotide is randomly incorporated.
(DNA संश्लेषण अभिक्रिया शुरू हो जाती है और श्रृंखला तब तक बढ़ती है जब तक कि समाप्ति न्यूक्लियोटाइड (ddNTP) को यादृच्छिक रूप से जोड़ा नहीं जाता है।)
v. The resulting DNA fragments are denatured into ssDNA.
(परिणामी DNA खण्डों को ssDNA में विकृत कर दिया जाता है।)
vi. The denatured fragments are separated by gel electrophoresis and the sequence is determined.
(विकृत हुए एकल रज्जुक टुकड़ों को जेल इलैक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किआ जाता है और अनुक्रम निर्धारित किया जाता है।)
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