Tools of genetic engineering (Restriction enzymes and Genomic library)

Restriction Enzyme (प्रतिबंधन एंजाइम):- It is a nuclease enzyme that cleaves DNA sequence at a specific recognition sites known as restriction sites. 

(यह एक न्यूक्लिएज एंजाइम है जो विशिष्ट पहचान स्थलों पर डीएनए अनुक्रम को काटता है जिसे प्रतिबंधन स्थलों के रूप में जाना जाता है।)

Discovery (खोज):- In 1970 the first restriction endonuclease enzyme HindII was isolated. For the subsequent discovery and characterization of numerous restriction endonucleases, in 1978 Daniel Nathans, Werner Arber, and Hamilton O. Smith awarded for Nobel Prize for Physiology or Medicine.

(1970 में पहला प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज एंजाइम HindII पृथक किया गया था। इसके पश्चात कई प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज की बाद की खोज और लक्षण वर्णन के लिए Daniel Nathans, Werner Arber, व Hamilton O. Smith को 1978 में Physiology या Medicine के लिए नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया।)

Restriction modification system (प्रतिबंधन रूपान्तरण तन्त्र):- In bacteria, modification enzymes methylate the bacterial DNA. Methylation of bacterial DNA at the recognition sequence typically protects the own DNA of the bacteria from being cleaved by restriction enzyme.

(जीवाणुओं में, रूपान्तरण एंजाइम जीवाणु DNA का मेथाइलिकरण करते हैं। पहचान अनुक्रम पर जीवाणु DNA का मेथाइलीकरण आमतौर पर जीवाणुओं के स्वयं के DNA को प्रतिबंधन एंजाइम द्वारा विदलन से बचाता है।)

Types (प्रकार):- There are two different kinds of restriction enzymes:

(दो भिन्न प्रकार के प्रतिबंधन एंजाइम होते हैं:)

(1) Exonucleases (एक्जोन्यूक्लिएज):- They catalyses hydrolysis of terminal nucleotides from the end of DNA or RNA molecule either 5’to 3’ direction or 3’ to 5’ direction. Example: exonuclease I, exonuclease II etc.

(ये DNA या RNA अणु के सिरे से न्यूक्लियोटाइड्स के जल अपघटन को या तो 5' से 3 'दिशा या 3' से 5' दिशा में उत्प्रेरित करते हैं। उदाहरण:- एक्जोन्यूक्लिएज I, एक्जोन्यूक्लिएज II आदि।)

(2) Endonucleases (एण्डोन्यूक्लिएज):- They can recognize specific base sequence (restriction site) within DNA or RNA molecule and cleave internal phosphodiester bonds within a DNA molecule. Example: EcoRI, Hind III, BamHI etc.

[ये DNA या RNA अणु के भीतर विशिष्ट क्षार अनुक्रम (प्रतिबंधन स्थल) को पहचान सकते हैं और DNA अणु के भीतर आंतरिक फॉस्फोडाइस्टर बन्ध को काट सकते हैं। उदाहरण:- EcoRI, Hind III, BamHI आदि।]

Restriction Endonuclease orRE (प्रतिबंधन एण्डोन्यूक्लिएज):-

Nomenclature (नामकरण):- Restriction endonucleases are named according to the organism in which they were discovered, using a system of letters and numbers. 

(प्रतिबंधन एण्डोन्यूक्लिएज का नाम उस जीव के अनुसार रखा जाता है जिसमें उन्हें खोजा गया था। इसमें अक्षरों व संख्याओं का उपयोग किया जाता है।)

For example, HindIII was discovered in Haemophilus influenza (strain d). The Roman numerals are used to identify specific enzymes from bacteria that contain multiple restriction enzymes indicating the order in which restriction enzymes were discovered in a particular strain.

[उदाहरण के लिए, Haemophilus influenza (प्रभेद d) में HindIII की खोज की गई थी। रोमन अंकों का उपयोग जीवाणुओं से विशिष्ट एंजाइमों की पहचान करने के लिए किया जाता है जिनमें अनेक प्रतिबंधन एंजाइम होते हैं जो उस क्रम को इंगित करता है जिसमें एक विशेष प्रभेद में प्रतिबंधन एंजाइम की खोज की गई थी।]

Classification of Restriction Endonucleases (प्रतिबंधन एण्डोन्यूक्लिएज का वर्गीकरण):- There are three major classes of restriction endonucleases based on the types of sequences recognized, the nature of the cut made in the DNA, and the enzyme structure -

(पहचाने गए अनुक्रमों के प्रकार, DNA में बने कट की प्रकृति और एंजाइम संरचना के आधार पर प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज के तीन प्रमुख वर्ग हैं -)

a. Type I restriction enzymes (टाइप I प्रतिबंधन एण्डोन्यूक्लिएज)

b. Type II restriction enzymes (टाइप II प्रतिबंधन एण्डोन्यूक्लिएज)

c. Type III restriction enzymes (टाइप III प्रतिबंधन एण्डोन्यूक्लिएज)

a. Type I restriction enzymes ((टाइप I प्रतिबंधन एण्डोन्यूक्लिएज)):-

> These enzymes have both restriction and modification activities. Restriction depends upon the methylation status of the target DNA.

(इन एंजाइमों में प्रतिबंधन और रूपान्तरण दोनों क्रियाएँ होती हैं। प्रतिबंधन लक्ष्य DNA की मेथाइलीकरण स्थिति पर निर्भर करता है।)

> Cleavage occurs approximately 1000 bp away from the recognition site.

(पहचान स्थल से लगभग 1000 क्षार युग्म दूरी पर विदलन होता है।)

> The recognition site is asymmetrical and is composed of two specific portions in which one portion contain 3–4 nucleotides while another portion contain 4–5 nucleotides and both the parts are separated by a non-specific spacer of about 6–8 nucleotides.

(पहचान स्थल असममित होता है और दो विशिष्ट भागों से बना होता है जिसमें एक भाग में 3–4 न्यूक्लियोटाइड होते हैं जबकि दूसरे भाग में 4–5 न्यूक्लियोटाइड होते हैं और दोनों भागों को लगभग 6–8 न्यूक्लियोटाइड के गैर-विशिष्ट स्पेसर द्वारा अलग किया जाता है।)

First portion - non-specific spacer - Second portion

3–4 nucleotides - 6–8 nucleotides - 4–5 nucleotides

प्रथम भाग - गैर विशिष्ट स्पेसर - द्वितीय भाग

3–4 न्यूक्लियोटाइड - 6–8 न्यूक्लियोटाइड - 4–5 न्यूक्लियोटाइड 

> They require S-adenosylmethionine (SAM), ATP, and magnesium ions (Mg2+) for activity.

[इन्हें सक्रियता के लिए S-adenosylmethionine (SAM), ATP और मैग्नीशियम आयन (Mg2+) की आवश्यकता होती है।]

> These enzymes are composed of mainly three subunits, a specificity subunit that determines the DNA recognition site, a restriction subunit, and a modification subunit.

[ये एंजाइम मुख्य रूप से तीन उप-इकाइयों से बने होते हैं, एक विशिष्टता उप-इकाई जो DNA पहचान स्थल का निर्धारण करती है, एक प्रतिबंधन उप-इकाई और एक रूपान्तरण उप-इकाई।]

> Examples (उदाहरण):- EcoB, EcoK

b. Type II restriction enzymes (टाइप II प्रतिबंधन एण्डोन्यूक्लिएज):-

> Restriction and modification are mediated by separate enzymes so it is possible to cleave DNA in the absence of modification. Although the two enzymes recognize the same target sequence, they can be purified separately from each other.

(प्रतिबंध और रूपान्तरण को भिन्न एंजाइमों द्वारा मध्यस्थ किया जाता है, इसलिए रूपान्तरण की अनुपस्थिति में DNA का विदलन संभव है। यध्यपि दो एंजाइम एक ही लक्ष्य अनुक्रम को पहचानते हैं, इन्हें एक दूसरे से अलग करके शुद्ध रूप में प्राप्त किया जा सकता है।)

> Cleavage of nucleotide sequence occurs at the restriction site.

(न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का विखंडन प्रतिबंध स्थल पर होता है।)

> These enzymes are used to recognize rotationally symmetrical sequence which is often referred as palindromic sequence.

(इन एंजाइमों का उपयोग व्युत्क्रम रूप से सममित अनुक्रम को पहचानने के लिए किया जाता है जिसे अक्सर पैलिंड्रोमिक अनुक्रम कहा जाता है।)

> These palindromic binding site may either be interrupted (e.g. BstEII recognizes the sequence 5´-GGTNACC-3´, where N can be any nucleotide) or continuous (e.g. KpnI recognizes the sequence 5´-GGTACC-3´).

[ये पैलिंड्रोमिक बंधन स्थल या तो बाधित हो सकती है (उदाहरण के लिए BstEII, अनुक्रम 5´-GGTNACC-3´ को पहचानता है, जहां N कोई न्यूक्लियोटाइड हो सकता है) या निरंतर हो सकती है (जैसे KpnI अनुक्रम 5´-GGTACC-3´ को पहचानता है)।]

> They require only Mg2+ as a cofactor and ATP is not needed for their activity.

(इन्हें सहकारक के रूप में केवल Mg2+ की आवश्यकता होती है और इनकी सक्रियता के लिए ATP की आवश्यकता नहीं होती है।)

> Type II endonucleases are widely used for mapping and reconstructing DNA in vitro because they recognize specific sites and cleave just at these sites.

(टाइप II एंडोन्यूक्लिएज व्यापक रूप से कृत्रिम रूप से DNA के मापन और पुनर्निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि ये इन स्थानों पर विशिष्ट स्थलों को पहचानकर काटते हैं।)

> Examples (उदाहरण):- EcoR I, BamH I

c. Type III restriction enzymes (टाइप III प्रतिबंधन एण्डोन्यूक्लिएज):-

> These enzymes recognize and methylate the same DNA sequence but cleave 24–26 bp away.

(ये एंजाइम एक DNA अनुक्रम को पहचानकर उसी का मेथाइलीकरण करते हैं परन्तु 24-26 क्षार युग्म दूर काटते हैं।)

> They have two different subunits, in which one subunit (M) is responsible for recognition and modification of DNA sequence and other subunit (R) has nuclease action.

(इनकी दो भिन्न उप-इकाइयाँ होती हैं, जिसमें एक उप-इकाई (M) DNA अनुक्रम की पहचान व रूपान्तरण के लिए उत्तरदायी होती है और अन्य उप-इकाई (R) में न्यूक्लिएज क्रिया होती है।)

> Mg+2 ions, ATP are needed for DNA cleavage and process of cleavage is stimulated by SAM.

(DNA विदलन के लिए Mg+2 आयन व ATP की आवश्यकता होती है और SAM द्वारा विदलन की प्रक्रिया को प्रेरित किया जाता है।)

> Cleave only one strand. Two recognition sites in opposite orientation are necessary to break the DNA duplex.

(यह केवल एक रज्जुक का विदलन करते हैं। DNA द्विरज्जुक को तोड़ने के लिए विपरीत अभिविन्यास में दो पहचान स्थलों की आवश्यक होती है।)

> Examples (उदाहरण):- EcoP I, Hinf III

Genomic Library (आनुवंशिक लाइब्रेरी):- It is a collection of the total genomic DNA from a single organism. The DNA is stored in a population of identical vectors, each containing a different insert of DNA.

(यह एक जीव से कुल आनुवंशिक DNA का संग्रहण है। DNA को एक समान वाहकों की समष्टि में संग्रहित किया जाता है जिनमें से प्रत्येक में DNA का एक अलग खण्ड होता है।)

> Collection of clones having the complete genomic DNA of an entity.

(यह एक जीव के सम्पूर्ण आनुवंशिक DNA वाले क्लोनों का संग्रहण है।)

> Represents all genes.

(यह सभी जीनों का प्रतिनिधित्व करता है।)

> Vast in comparison to cDNA library.

(यह cDNA लाइब्रेरी की तुलना में विशाल होती है।)

> Contains sequences for introns and exons. Genomic clones can have sequences of the complete gene.

(इसमें इंट्रॉन व एक्सॉन के अनुक्रम होते हैं। जीनोमिक क्लोन में संपूर्ण जीन के अनुक्रम हो सकते हैं।)

> Large number of recombinants to be screened.

(बड़ी संख्या में पुनर्योजियों की जांच की जाती है।)

> Gene expression extracted from the genomic library is challenging in the prokaryotic systems, as they are devoid of a splicing mechanism.

(आनुवंशिक लाइब्रेरी से निकाली गई जीन अभिव्यक्ति प्रोकैरियोटिक तंत्रों में चुनौतीपूर्ण होती है, क्योंकि ये  स्प्लाइसिंग तंत्र से रहित होते हैं।)